گزینش لاین سلولی پربازده و ایجاد سوسپانسیون سلولی تولید‌‌کنندة بالای تاکسول در درخت سرخدار (Taxus baccata L.)

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران

2 دانشیار، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه، ارومیه، ایران

چکیده

مقدمه و هدف: سرخدار (Taxus baccata L.) از درختان سوزنی‌برگ کندرشد و همیشه‌سبز جنگل­های هیرکانی ایران است که به‌دلیل تولید تاکسول، داروی حیاتی ضد سرطان، ارزش دارویی فراوانی دارد. با این حال، غلظت بسیار پایین تاکسول در گونه‌های سرخدار (001/0 تا 02/0 درصد وزن خشک) مانع اصلی بهره‌برداری پایدار است. برای تهیه تنها یک کیلوگرم تاکسول به حدود 10 هزار کیلوگرم پوست یا قطع سه هزار درخت سرخدار نیاز است، درحالی­که درمان یک بیمار سرطانی به سه گرم تاکسول معادل هشت درخت 60 ساله نیاز دارد. این مسئله خطر جدی برای بقای جنگل‌های طبیعی ایجاد می‌کند. از این‌رو، پژوهشگران زیست‌فناوری به‌دنبال روش‌های جایگزین مانند کشت سلول و بافت برای تولید متابولیت‌های ثانویه در مقیاس‌های بزرگ و بدون آسیب به محیط‌زیست هستند. کشت سوسپانسیون سلولی یکی از رویکردهای مؤثر برای تولید متابولیت‌های دارویی در شرایط آزمایشگاهی محسوب می‌شود. استفاده از لاین‌های سلولی پرتوان و گزینش‌شده می‌تواند منجر به افزایش چشمگیر تولید زیست‌توده و تاکسول شود. در این پژوهش، با بهره‌گیری از روش کلونینگ توده‌های سلولی کوچک، لاین‌های سلولی با بازده بالا شناسایی و کشت‌های سوسپانسیون همگن برای تولید کارآمد تاکسول در سرخدار ایجاد شد.
مواد و روش‌ها: ریزنمونه‌های ساقه جوان درختچه‌های سرخدار یک ساله در محیط کشت B5 حاوی غلظت‌ها و ترکیبات مختلف اکسین (2,4-D، PIC، NAA) و سیتوکینین (BAP، KIN) برای القای کالوس کشت داده شدند. القای موفقیت‌آمیز کالوس و بهترین ترکیبات فیتوهورمونی توسط عوامل متعددی مانند زمان القای کالوس، مقدار کالزایی و مورفولوژی کالوس (بافت و رنگ) تعیین شد. کالوس‌های مناسب گزینش شدند و برای ایجاد کشت سوسپانسیون سلولی اولیه مورد استفاده قرار گرفتند. پس از ایجاد کشت‌های سوسپانسیون مختلف، لاین‌های سلولی پربازده با استفاده از روش کلونینگ توده‌های سلولی کوچک گزینش شدند. سوسپانسیون‌های سلولی به­دست آمده از لاین‌های برتر گزینش شده از نظر سینتیک رشد، تجمع تاکسول، پایداری رشد و تولید متابولیت مورد آنالیز قرار گرفتند. همه آزمایش‌ها دو بار تکرار شدند و آزمایش‌ها بر پایه طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار تنظیم شدند. آنالیز واریانس داده‌ها و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از نرم­افزار آماری SAS 9.4 انجام شد.
یافته‌ها: تأثیر فیتوهورمون‌ها بر روی کالزایی، انواع مورفولوژی کالوس را، بسته به نوع فیتوهورمون و غلظت، نشان داد که ترکیب PIC و KN برای القای کالوس نرم، شکننده و تند‌رشد مؤثرتر بود. چهار کلونی مشتق از تک سلول با ویژگی­های رشدی خوب از کشت‌های مختلف سوسپانسیون سلولی T. baccata با استفاده از روش کلونینگ توده‌های سلولی گزینش و کشت‌های سوسپانسیون سلولی از لاین‌های سلولی گزینش شده ایجاد شدند. پروفیل زمانی رشد سلول‌ها در کشت‌های سوسپانسیون نشان داد که مرحله رشد نمایی تا روز 21 ادامه داشت و به دنبال آن فاز ساکن، که از روزهای 21 تا 28 سیکل رشد ادامه داشت، طی آن رشد سلولی به‌طور محسوسی تغییر نکرد. با توجه به منحنی رشد، بهترین زمان برای تولید تاکسول در فاز نمایی نهایی، یعنی تا روز 21‌ام با بیشینه مقدار رشد سلولی، است. لاین برتر بیشترین مقدار تاکسول (mg/l 07/26) را با تولید قابل توجهی زیست­توده (g DW/l 68/33)  تولید کرد که به­ترتیب تقریباً 15 و 05/2 برابر بیشتر از لاین کم بازده بود. در بررسی دینامیک جمعیت سلولی لاین برتر مشخص شد که اغلب از فراکسیون‌های توده‌های سلولی کروی شکل هستند که توانایی سریع تقسیم و با مقدار زنده‌مانی بالا هستند. آنالیز پایداری لاین‌های گزینش شده نشان داد در بین لاین‌ها از نظر پایداری در تولید زی‌توده و متابولیت در طی ‌واکشت‌های متوالی تفاوت معنی‌دار وجود دارد، که فقط لاین TbCL-J1 از نظر رشد و تجمع زی‌توده و تولید تاکسول پس از پنج نسل واکشت‌، پربازده و پایدار باقی ماند.
نتیجه‌گیری: این پژوهش موفق به گزینش یک لاین سلولی پربازده و ایجاد کشت سوسپانسیون سلولی پرتوان برای تولید تاکسول، داروی ارزشمند ضد سرطان شد. میزان تولید تاکسول در لاین منتخب به‌طور چشمگیری (77/0 درصد زی‌توده خشک) بالاتر از مقادیر گزارش‌شده در درختان سرخدار جنگلی (001/0 تا 02/0 درصد) بود. راهبرد انتخاب لاین سلولی علاوه بر افزایش تولید تاکسول، موجب رشد بیشتر زیست‌توده نیز شد. این روش مبتنی بر کلونینگ توده‌های سلولی، قابلیت کاربرد در سایر سیستم‌های کشت گیاهی را دارد. همچنین، کشت همگن حاصل از انتخاب تک‌سلول در سرخدار با سرعتی بیشتر از درختان جنگلی تکثیر می‌شود و برای مقیاس‌پذیری، مهندسی متابولیک و صنعتی‌سازی در بیوراکتور مناسب است، بدون آنکه نیاز به بهره‌برداری مخرب از جنگل‌های بومی ایران باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Selection of high-yielding cell line and establishment of high Taxol-producing cell suspension culture in European yew tree (Taxus baccata L.)

نویسندگان [English]

  • Aida Javanmard 1
  • Morad Jafari 2
1 PhD Student of Molecular Genetics and Genetic Engineering, Department of Genetics and Plant Production, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, I. R. Iran
2 Associate Professor, Department of Genetics and Plant Production, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia, I. R. Iran
چکیده [English]

Background and Objective: European yew (Taxus baccata L.) is a slow-growing, evergreen conifer native to northern Iran with high medicinal value due to its production of paclitaxel (Taxol), a vital anticancer drug. However, the extremely low concentration of paclitaxel in yew tissues (0.001–0.02% of dry weight) poses a major barrier to sustainable exploitation. Producing just one kilogram of paclitaxel requires about 10,000 kg of bark or the felling of 3,000 trees, while treating a single cancer patient needs approximately 3 g of paclitaxel—equivalent to eight 60-year-old trees. Such demand threatens the survival of natural yew forests. Consequently, biotechnologists seek alternative strategies, such as cell and tissue culture, for large-scale production of secondary metabolites without environmental damage. Cell suspension culture is considered an effective approach for producing medicinal metabolites under controlled laboratory conditions. Establishing high-yield, selected cell lines can significantly enhance biomass and paclitaxel production. This study aimed to develop efficient paclitaxel-producing suspension cultures of T. baccata by selecting high-yield cell lines through small cell aggregate cloning.
Material and Methods: Stem explants from one-year-old yew seedlings were cultured on B5 medium supplemented with various auxins (2,4-D, PIC, NAA) and cytokinins (BAP, KIN) to induce callus formation. Successful induction and optimal phytohormone combinations were determined based on induction time, callus morphology (texture and color), and callogenic response. Selected calli were used to establish primary cell suspension cultures. High-yield cell lines were isolated by cloning small cell aggregates. Resulting suspension cultures from selected lines were analyzed for growth kinetics, paclitaxel accumulation, growth stability, and metabolite production. All experiments were conducted in a completely randomized design with three replicates, repeated twice, and analyzed using SAS 9.4.
Results: Phytohormones significantly influenced callogenesis, with PIC and KIN producing friable, fast-growing callus. Four single-cell-derived clones with superior growth performance were selected from T. baccata suspension cultures. Growth profiling revealed an exponential phase up to day 21, followed by a stationary phase until day 28. Paclitaxel production peaked at the late exponential phase (day 21), coinciding with maximum cell growth. The best-performing line produced the highest paclitaxel yield (26.07 mg/L) and biomass (33.68 g DW/L), about 15-fold and 2.05-fold higher, respectively, than the low-yield line. Cell population dynamics indicated that the superior line predominantly consisted of spherical cell aggregates with rapid division rates and high viability. Stability analysis showed significant differences among lines across subcultures, with only line TbCL-J1 maintaining high productivity and stability in biomass and paclitaxel yield after five successive subcultures.
Conclusion: This study successfully established a high-yield cell line and developed efficient T. baccata cell suspension cultures for paclitaxel production. Paclitaxel yield in the selected line (0.77% of dry biomass) was dramatically higher than that reported for natural yew trees (0.001–0.02%). The cell line selection strategy not only boosted paclitaxel yield but also enhanced biomass accumulation. The small-aggregate cloning method offers potential for application in other plant culture systems. Moreover, the homogeneous cultures derived from single-cell selection in T. baccata proliferate more rapidly than wild trees, making them suitable for scale-up, metabolic engineering, and industrial bioreactor applications—without destructive harvesting of Iran’s native forests.

کلیدواژه‌ها [English]

  • B5 medium
  • Callus induction
  • Cell aggregate cloning
  • Secondary metabolites

مراجع

Ahadi, H.; Mirjalili, M. H.; Farzaneh, M.; rezadoos, H., Quantification of taxol and 10- deacetyl baccatin III in the leaf and cell suspension cultures of two taxus species. Journal of Plant Productions 2018, 41 (3), 95-105. (In Persian)
Ashrafi, S.; Mofid, M. R.; Otroshi, M.; Ebrahimi, M.; Khosroshahli, M., Effect of plant growth regulators on the callogenesis and taxol production in cell suspension of Taxus baccata L. Trakia Journal of Sciences 2010, 8(2), 36-43.
Bagheri Toulabi, S.; Moieni, A.; Ghanati, F.; Emami, F., Investigation of the effects of the basal medium, auxin and antioxidants on the induction and maintenance of callus and taxol production in yew (Taxus baccata). Journal of Advances in Biology & Biotechnology 2015, 3(2), 58-67.
Bonfill, M.; Bentebibel, S.; Moyano, E.; Palazon, J.; Cusido, R.M.; Eibl, R.; Pinol, M.T., Paclitaxel and baccatin III production induced by methyl jasmonate in free and immobilized cells of Taxus baccata. Journal of Biologia Plantarum 2007, 51 (4), 647-52.
Bray, F.; Laversanne, M.; Sung, H.; Ferlay, J.; Siegel, R. L.; Soerjomataram, I., Jemal, A., Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer Journal for Clinicians 2024, 74(3), 229-263.
Brunakova, K; Babincova, Z.; Takác, M.; Cellárová, E., Selection of callus cultures of Taxus baccata L. as a potential source of paclitaxel production. Engineering in Life Sciences 2004; 4 (5), 465-9.
Chandran, H.; Meena, M.; Barupal, T.; Sharma, K.; Plant tissue culture as a perpetual source for production of industrially important bioactive compounds. Biotechnology Reports 2020, 26:e00450.
Christen, A.A.; Bland, J.; Gibson, D.M., Cell culture as a means to produce taxol. Journal of Proceedings of the American Association for Cancer Research 1989, 30:2252.
Cusidó, R. M.; Palazón, J.; Navia-Osorio, A.; Mallol, A.; Bonfill, M.; Morales, C.; et al., Production of Taxol and baccatin III by a selected Taxus baccata callus line and its derived cell suspension culture. Plant Science 1999, 146, 101-7.
Deepthi, S.; Satheeshkumar, K., Cell line selection combined with jasmonic acid elicitation enhance camptothecin production in cell suspension cultures of Ophiorrhiza mungos L. Journal of Applied Microbiology Biotechnology 2017, 101(2), 545-558.
Denis, J.N.; Greene, A.E.; Guenard, D.; Gueritt-Voegelein, F.; Managatal, L.; Poiter, P., Highly efficient approach to natural taxol. Journal of the American Chemical Society 1998, 110 (17), 5917-5919.
Dong, J.; Bowra, S.; Vincze, E., The development and evaluation of single cell suspension from wheat and barley as a model system; a first step towards functional genomics application. BMC Plant Biology 2010, 5 (10), 239.
Dougall, K. D., Cell cloning and selection of high yielding strains. In Cell culture and somatic cell genetic of plants; Constabel, F.; Vasil, I. K., Ed.; Academic Press, INC: San Diego, CA, 1987; pp117-123.
Fathollahi Qarachoboogh, A.; Alijanpour, A.; Hosseini, B.; Banj Shafiei, A., The effects of different plant growth regulators on micropropagation of Juniperus foetidissima Willd. Forest Research and Development 2020, 6(4), 573-591. (In Persian)
Fathollahi Qarachoboogh, A.; Alijanpour, A.; Hosseini, B.; Banj Shafiei, A., The effects of different plant growth regulators on micropropagation of Juniperus excelsa L. Forest Research and Development 2025, doi: 10.30466/jfrd.2024.55374.1728. (In Persian)
Fujita, Y.; Takahashi, S.; Yamada, Y., Selection of cell lines with high productivity of shikonin derivatives by protoplast culture of Lithospermum erythrorhizon cells. Agricultural and Biological Chemistry 1985, 49, 37-41.
Gamborg, O. L.; Miller R. A.; Ojima K, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 1968, 50:151-158.
Habibi Khaniani, B.; Moieni, A.; Abdollahi, M., Production of secondary metabolites and pharmaceutical constituents through tissue and cell culture. Journal of Medicianal Plants 2005, 4 (14), 1-6. (In Persian)
Hasanloo, T.; rezazadeh, S.; Rahnama, H.; Hairy roots as a Source for Production of Valuable Pharmaceutical materials. Journal of Medicianal Plants 2009; 8 (29), 1-17. (In Persian)
Hazrati Jahan, R.; Zare, N.; Dezhsetan, S.; Shikhzadeh Mosaddeg, P., Enhanceed Taxol production in cell suspension cultures of hazelnut (Corylus avellana L,.) by combination of elicitor and precursor. Journal of Medicinal and Aromatic Plants 2017, 33 (1), 73- 89. (In Persian)
Larkin, P. J.; Scowcroft, W. R., Somaclonal variation - a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical and Applied Genetics, 1981, 60(4), 197-214.
Liang, L. F.; Keng, C. L.; Lim, B. P., Selection of cell lines for the production of rosmarinic acid from cell suspension cultures of Orthosihon stamineus benth. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 2006, 42, 538- 542.
Malik, S.; Cusido, R. M.; Mirjalili, M. H.; Moyano, E.; Palazon, J.; Bonfill, M., Production of the anticancer drug taxol in Taxus baccata suspension cultures: A review. Journal of Process Biochemistry 2011, 46, 23-34.
Markowski, M.; Czarnomska, Z.; Tomiczak, K.; Mikuła, M.; Granica, S.; Podwyszyńska, M.; Szypuła W.J., The influence of cryopreservation via encapsulation-dehydration on growth kinetics, embryogenic potential and secondary metabolite production of cell suspension cultures of Gentiana capitata Buch.-Ham. ex D. Don and Gentiana decumbens L.f. Indastrial Crops and  Products 2024, 212, 11834.
Matsumoto, T.; Kanno, N.; Ikeda, T.; Obi, Y.; Kisaki, T.; Noguchi, M., Selection of cultured tobacco cell strains producing high levels of ubiquinone 10 by a cell cloning technique. Agricultural and Biological Chemistry 1981, 45, 1627-1633.
Naill, M. C.; Roberts, S. C., Culture of isolated single cells from Taxus suspensions for the propagation of superior cell populations. Biotechnology Letters 2005, 27, 1725-1730.
Nirmala, M. J.; Samundeeswari, A.; Sankar, P. D., Natural plant resources in anti-cancer therapy-A review. Journal of Research in Plant Biology 2011, 1 (3), 1-14.
Palazon, J.; Cusido, R. M.; Bonfill, M.; Morales, C; Pinol, M. T., Inhibition of paclitaxel and baccatinIII accumulation by mevinolin and fosmidomycin in suspension cultures of Taxus baccata. Journal of Biotechnology 2003, 101 (2), 157-163.
Perez-Matas, E.; Hidalgo-Martinez, D.; Moyano, E.; Palazon, J.; Bonfill, M., Overexpression of BAPT and DBTNBT genes in Taxus baccata in vitro cultures to enhance the biotechnological production of paclitaxel. Plant Biotechnology Journal 2024, 22 (1), 233-247.
Rahmati, Z.; Payam nour, V.; Ghasemi Bezdi, K.; Ebrahimi, P., Optimization of culture medium for in vitro callogensis in Taxus baccata L. and T. berevifolia Nut. Journal of Forest and wood products 2017, 70 (3), 381-391. (In Persian).
Rana, S.; Dhar, N.; Bhat, W. W.; et al., A 12-deoxywithastramonolide-rich somaclonal variant in Withania somnifera (L.) Dunal-molecular cytogenetic analysis and significance as a chemotypic resource. In Vitro Cellular & Developmental Biology- Plant 2012, 48, 546-554.
Razavi, S.A.; Hosseini Nasr, S. M.; Valizadeh, M., Effect of cutting type and plant growth regulators (IBA, NAA, 2, 4-D) on rooting of Taxus baccata L. cuttings. Forest Research and Development 2018, 4(1), 73-83. (In Persian)
Vidal-limon, H. R.; Almargo, L.; Moyano, E.; Palazon, J.; Perdreno, M.A.; cusido, R.M., Perfluorodecalins and hexenol as inducers of secondary metabolism in Taxus media and Vitis vinifera cell cultures. Journal of Frontiers in Plant Science 2018, 9, 335-349.
Wang, S.; Wang, H.; Li, T.; et al., The selection and stability analysis of stable and high Taxol-producing cell lines from Taxus cuspidata. Journal of Forest Research 2018, 29, 65-71.
Wickremesinhe, E. R. M.; Arteea, R. N., Taxus callus cultures: Initiation, growth optimization, characterization and taxol production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 1993, 35, 181-193.
Witherup, K. M.; Look, S. A; Stasko, M. W.; Ghiorzi, T. J.; Muschik, G. M.; Cragg, G. M., Taxus spp. needles contain amounts of taxol comparable to the bark of Taxus brevifolia: analysis and isolation. Journal of Natural Products 1990, 53 (5), 1249-1255.
Yari Khosroushahi, A.; Naderi-Manesh, H.; Toft Simonsen, H., Effect of antioxidants and carbohydrates in callus cultures of Taxus brevifolia: Evaluation of browning, callus growth, total phenolics and paclitaxel production. Bioimpacts 2011, 1(1), 37-45.
Yazdani, D.; Shahnazi, S.; Rezazadeh, S.; Pirali Hamadani, M., Review on yew tree (Taxus spp.). Journal of Medicianal Plants 2005, 4 (15), 1-8. (In Persian)
Zhang, C. H.; Fevereiro, P. S.; He, G.; Chen, Z., Enhanced paclitaxel productivity and release capacity of Taxus chinensis cell suspension cultures adapted to chitosan. Journal of Plant Science 2007, 172, 158-163.
Zhang, D.; Li, Z.; Htwe, Y. M.; Shi, P.; Wei, X.; Nie, H.; Nin, J.; Wu, L.; Khan, F. S.; Yu, Q.; et al., Insights into the developmental trajectories of zygotic embryo, embryogenic callus and somatic embryo in coconut by single-cell transcriptomic analysis. Industrial Crop and Products 2024, 212, 118338.
Zaranek, M.; Pérez-Pérez, R.; Milewska-Hendel, A.; et al., Efficient and rapid system of plant regeneration via protoplast cultures of Fagopyrum esculentum Moench. Plant Cell and Tissue Organ Culture 2023, 154, 673-687.
پژوهش و توسعه جنگل
دوره 11، شماره 2
شهریور 1404
صفحه 183-204

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار